En 1503 se estableció por decreto real la Casa de Contratación de Indias en Sevilla, creada para fomentar y regular el comercio y la navegación con el Nuevo Mundo. Su denominación oficial era Casa y Audiencia de Indias

Su funcionamiento quedó regulado en las Ordenanzas expedidas en Alcalá de Henares en el momento de su creación, y entre sus finalidades se especificaban las de "recoger y tener en ella, todo el tiempo necesario, cuantas mercaderías, mantenimientos y otros aparejos fuesen menester para proveer todas las cosas necesarias para la contratación de las Indias; para enviar allá todo lo que conviniera; para recibir todas las mercaderías e otras cosas que de allí se vendiese dello todo lo que hubiese de vender o se enviase a vender e contratar a otras parte donde fuese necesario". Su reglamento fue modificado por las Ordenanzas expedidas en Monzón en 1510 y toda la legislación referente a este organismo se imprimió en 1522.

Las Ordenanzas de 1510 son más extensas y minuciosas que las de 1503. Se especificaban las horas de trabajo; se habla de los libros de registro que hay que llevar; se regula la emigración; se trata de las relaciones con mercaderes y navegantes; se dispone lo relativo a los bienes de los muertos en Indias, y se le incorpora el matiz científico al incluirse dentro de la Casa de la Contratación al Piloto Mayor -creado en 1508-, encargado de examinar a los pilotos que desean hacer la carrera, y de trazar los mapas o cartas de navegación y el Padrón Real o mapa-modelo del Nuevo Mundo, hasta 1519 en que se crea el puesto de Cartógrafo. Piloto Mayor en 1508 fue Américo Vespucio, sucediéndole más tarde Juan de Solís y Sebastián Cabot. A mediados del siglo la Casa del Océano -como gustaba llamarla Mártir de Anglería- era un organismo bien reglamentado, con capilla y cárcel propia.

Como controladora del tráfico marítimo, la Casa se encargaba del aprovisionamiento y del pertrecho de las flotas, y de la inspección de los barcos que se disponían a zarpar para América. Sus funcionarios aparejaban las flotas, compraban mercancías, daban instrucciones a los navíos, fomentaban el trato con Indias, estaban atentos a las necesidades de Ultramar, y cuidaban del registro de todas las embarcaciones.

Los principales funcionarios de la Casa de la Contratación eran su presidente, aunque este cargo no se creó hasta 1557, y tres oficiales, que a partir de esta fecha pasaron a depender de él: un contador, un factor y un tesorero. Había también un piloto jefe, del que dependían la organización de las exploraciones, el establecimiento de cartas marinas, la escuela de pilotos y cosmógrafos y la concesión de licencias de oficial de marina. El cronista oficial de la Casa escribía la historia de la América española y de su desarrollo teconológico y científico. Los que violaban el reglamento de la Casa, caían bajo su jurisdicción y para ello se creó un tribunal especial en 1583.

Además de estos cargos, la Casa de la Contratación fue aumentando el número de sus funcionarios, a medida que fue incrementándose también la importancia del tráfico americano. Los oficiales de contaduría, numerosos escribanos, hicieron de esta institución una de las más complejas de todas la existentes en la Sevilla de los Austrias.

Por la estructura que se da a la Casa se adivina una estrecha relación con la Hacienda Real. Difícilmente hubiera podido ser de otra forma. El tesoro de la Corona ocupaba una parte medular de los asuntos indianos. Por una parte, servía para financiar la compra y transporte de la mayoría de los bastimentos y pertrechos que eran llevado a Indias. Muchos de los colonizadores gozaban de salario a cargo del tesoro. Por la otra, los asientos para la formación de toda nueva expedición incluían expresamente cláusulas mediante las cuales se aseguraba el interés de la Hacienda Real en los beneficios económicos del viaje. Al efecto, eran comisionados funcionarios que acompañarían a los descubridores en sus andanzas y velarían por la adecuada satisfacción de los derechos reales.